Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, Metode Next-Generation Sequencing dan Metode Sekunsing DNA generasi ke 3


Sekuensing DNA adalah suatu metode untuk mengetahui urutan basa nitrogen dalam suatu rangkaian DNA. Dengan metode tersebut, para peneliti, saat ini telah mengetahui (melakukan sekuensing) urutan basa nitrogen pada keseluruhan genom manusia dan berbagai spesies lain.
Awalnya, sekuensing DNA genom manusia membutuhkan biaya sekitar 1 juta dollar. Namun dengan perkembangan inovasi dan teknologi, semakin tahun biaya yang dibutuhkan untuk sekuensing DNA semakin murah dan cepat. Bahkan untuk sekuensing keseluruhan genom manusia saat ini hanya membutuhkan biaya sekitar 900 dollar dalam waktu 6 jam.

Sekuensing DNA menggunakan metode Sanger

Sekuensing DNA secara otomatis pertama kali dilakukan oleh seorang ahli biokimia yang bernama Frederick Sanger dengan teknik dideoxyribonucleotide (or dideoxy) chain termination sequencing atau sering kali disebut dengan teknik / metode Sanger. Berkat metode / teknik tersebut Frederick Sanger berhasil memenangkan penghargaan Nobel pada tahun 1980.
Prinsip dari Sekuensing DNA dengan metode Sanger adalah sebagai berikut :
1. Fragmen DNA dengan panjang sekitar 800 – 1000 pasang basa didenaturasi, dicampur dengan primer, DNA polimerasi, 4 macam dNTPs (deoxyribonucleotide) yaitu deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP) dan deoxycytidine triphosphate (dCTP) dan 4 macam ddNTPs (dideoxyribonucleotide). ddNTPs (dideoxyribonucleotide) yang digunakan dalam metode Sanger tersebut telah dilabeli dengan fluorescent.
 Perbedaan antara dNTPs (deoxyribonucleotide) dan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) terletak gugus kimia yang menempel pada ujung 3’. dNTPs (deoxyribonucleotide) mempunyai gugus –OH pada ujung 3’ sedangkan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) tidak mempunyai gugus –OH pada ujung 3’.
2. Jika primer mereplikasi DNA dengan menambahkan dNTPs (deoxyribonucleotide) maka proses replikasi DNA tersebut akan terus berjalan karena gugus –OH pada ujung tiga bisa ditempeli oleh dNTPs atau ddNTPs. Namun jika primer mereplikasi DNA dengan menambahkan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) proses replikasi DNA tersebut akan terhenti karena ddNTPs (dideoxyribonucleotide) tidak dapat ditempeli dNTPs atau ddNTPs baru pada ujung 3’ nya (ujung 3’ tidak mempunyai gugus -OH).
3. Dengan adanya dNTPs (deoxyribonucleotide) dan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) maka dalam campuran tersebut akan terbentuk fragmen- fragmen DNA hasil replikasi dengan ukuran yang berbeda-beda sebanyak jumlah basa nitrogen dari template DNA yang digunakan. Campuran tersebut kemudian dilewatkan pada suatu pipa kapiler yang dapat memisahkan fragmen –fragmen DNA dalam larutan berdasarkan beratnya (panjang fragmen). Fragmen – fragmen DNA yang telah terpisah-pisah tersebut kemudian dideteksi secara berurutan mengunakan fluorescence detector sehingga dihasilkan urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) yang menempel pada tiap-tiap ujung fragmen. Urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) tersebut merupakan urutan basa komplementer dari DNA template.  
Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing, Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, sekuensing adalah, sequensing adalah, sekuensing DNA generasi ke tiga, Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3
Gambar 1. Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger


Sekuensing DNA menggunakan metode Next-Generation Sequencing

Para peneliti terus mengembangkan teknik sekuensing DNA. Untuk sekuensing DNA dalam jumlah besar misalkan sekuensing genom manusia, metode Sanger mulai ditinggal. Para peneliti mulai menggunakan metode atau teknik yang sering kali disebut dengan “next-generation sequencing”.
Prinsip kerja sekuensing DNA dengan teknik / metode next-generation sequencing adalah sebagai berikut :
1. Genom DNA yang akan disekuensing terlebih dahulu harus dipotong potong dengan ukuran 400 sampai 100 pasang basa per potongan (fragmen).
2. Tiap – tiap fragmen DNA diisolasi dalam larutan yang berisi manik (bead).
3. Fragmen DNA tersebut kemudian diperbanyak dengan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Manik (bead) yang ada dalam larutan tersebut mampu mengikat single strand DNA hasil perbanyakan DNA dengan Polimerase Chain Reaction (PCR) pada ujung 5’ sehingga seluruh copi DNA hasil Polimerase Chain Reaction (PCR) terikat pada manik (bead).
4. Manik (bead) yang telah mengikat single strand DNA kemudian dimasukkan ke dalam salah salah satu sumuran (well). Sumuran (well) tersebut berisi primer dan DNA polimerase sehingga dapat menghibridisasi single strand DNA yang menempel pada manik (bead).
5. Pada alat tersebut terdapat 2 juta sumuran yang masing – masing diisi fragmen – fragmen DNA genom yang akan disekuensing.
Sumuran ynag telah terisi single strand DNA, primer dan DNA polimerase kemudian ditambahkan dengan 4 jenis dNTPs (deoxyribonucleotide) yaitu deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP) dan deoxycytidine triphosphate (dCTP) secara bergantian. Tiap – tiap akan dilakukan pergantian jenis dNTPs (deoxyribonucleotide) sumuran dicuci terlebih dahulu agar tidak terkontaminasi dNTPs (deoxyribonucleotide) yang ada sebelumnya.

Baca Juga : Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

6. Jika dNTPs (deoxyribonucleotide) yang ditambahkan dalam sumuran komplemanter dengan basa nitrogen dari single strand DNA, Misalnya basa nitrogen dari single strand DNA yang belum berpasangan dengan dNTPs (deoxyribonucleotide) adalah Timin (T) sedangkan dNTPs (deoxyribonucleotide) yang ditambahkan dalam sumuran adalah dTTP, maka keduanya akan berpasangan dan melepaskan PPi. PPi tersebut akan menghasilkan cahaya yang kemudian direkam oleh mesin.
7. Sumuran kemudian dicuci dan ditambah dNTPs (deoxyribonucleotide) lain, Jika dNTPs (deoxyribonucleotide) yang ditambahkan dalam sumuran tidak komplemanter dengan basa nitrogen dari single strand DNA,misalnya basa nitrogen dari single strand DNA yang belum berpasangan dengan dNTPs (deoxyribonucleotide) adalah Guanin (G) sedangkan dNTPs (deoxyribonucleotide) yang ditambahkan dalam sumuran adalah dTTP, maka keduanya tidak berikatan dan tidak menghasilkan PPi.
8. Proses tersebut diulang-ulang hingga seluruh basa nitrogen dari single strand DNA berpasangan dengan komplementernya. Ada tidaknya cahaya PPi tersebut lah yang akan di rekam dan diolah sehingga didapatkan data urutan basa nitrogen dari fragmen single strand DNA.
Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing, Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, sekuensing adalah, sequensing adalah, sekuensing DNA generasi ke tiga, Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3
Gambar 2. Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing

Sekuensing DNA menggunakan metode sekunsing generasi ketiga (third generation sequencing)



Para peneliti terus mengembangkan berbagai teknik / metode sekuensing DNA yang lebih cepat, murah dan effisien yang dikenal dengan metode sekuensing DNA generasi ke tiga. Dengan metode ini, DNA genom yang akan disekuensing tidak perlu dipotong – potong. Ikatan ganda pada DNA genom tersebut diputus. Single stranded DNA kemudian dilewatkan pada pori kecil (berukuran nano) yang tertanam pada suatu protein membran. Pori kecil tersebut protein serupa dengan protein integral yang terdapat pada membran fosfolipid bilayer. Basa nitrogen (nukleotida) yang masuk ke dalam pori tersebut akan menimbulkan suatu arus. Arus yang dihasilkan oleh suatu nukleotida berbeda-beda sehingga perbedaan tersebut dapat dimanfaatkan untuk mengetahui sekuen DNA yang sedang melewati pori.
Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing, Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, sekuensing adalah, sequensing adalah, sekuensing DNA generasi ke tiga, Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3
Gambar 3. Konsep sekuensing DNA generasi ke tiga



Kata Kunci Pencarian : 
Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing, Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, sekuensing adalah, sequensing adalah, sekuensing DNA generasi ke tiga, Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3
Load disqus comments

0 comments