Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction)



Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah analisis yang saat ini banyak dilakukan untuk berbagai kepentingan. Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah perbanyakan suatu fragmen DNA yang dinginkan secara invitro.
 Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) merupakan analisis yang berbasis pada DNA (Deoxyribonucleic acid) sehingga memiliki tingkat keakuratan yang tinggi. Adapun pembahasan tentang PCR dapat dibaca pada postingan Tahapan dan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) memerlukan suatu primer. Primer pada Analisis PCR (Polimerase Chain Reaction) berperan untuk memulai atau menginisiasi hibridisasi DNA pada tahapan PCR (Polimerase Chain Reaction). Sebelum melakukan analisis PCR (Polimerase Chain Reaction), perlu dilakukan desain primer terlebih dahulu untuk menentukan DNA target yang ingin diperbanyak.




Keberhasilan dalam melakukan analisis PCR (Polimerase Chain Reaction)  sangat ditentukan dari primer yang digunakan. Perancangan/desain primer harus memperhatikan beberapa hal agar hasil PCR (Polimerase Chain Reaction) sesuai dengan target yang diinginkan. Adapun hal-hal yang harus diperhatikan dalam mendesain primer adalah sebagai berikut :

a. Panjang Primer PCR

Primer PCR idealnya memiliki panjang antara 18 sampai 30 oligonukleotida. Panjang tersebut diharapkan cukup untuk dapat mengikat DNA template pada suhu annealing dan mendapatkan sequen yang spesifik. Panjang primer ideal berkisar 18 -30 basa didasarkan pada pertimbangan kombinasi acak yang mungkin ditemukan pada satu urutan genom. Probabilitas menemukan 1 basa A, G, C atau T pada satu basa adalah ¼ (4-1), probabilitas menemukan 2 urutan basa nitogen (AG, AC, CG, dll) adalah 1/16 (4-2), probabilitas menemukan 4 urutan basa nitrogen (ACGT, CGAT, dll) adalah 1/256 (4-4). Sehingga 17 basa primer secara statistik akan ditemukan sekali dalam setiap 417 urutan basa nitrogen. Penggunaan primer   lebih dari 30 basa tidak disarankan karena tidak akan menunjukkan spesifisitas yang lebih tinggi. Selain itu, primer PCR yang terlalu panjang dapat berakibat terhibridasi dengan primer lain sehingga tidak terjadi polimerisasi DNA.

b. Primer Melting Temperature (Tm)

Primer Melting Temperature (Tm) adalah  suhu  yang diperlukan oleh primer PCR untuk mengalami disosiasi / lepas ikatan. Idealnya, Tm berkisar antara 52-58oC. Primer PCR dengan Tm yang terlalu tinggi  akan mengurangi efektifitas anealing sehingga proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik. Sedangkan Tm yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel ditempat lain sehingga menghasilkan produk yang tidak spesifik. Terdapat beberapa rumus yang dipakai untuk menentukan Tm suatu primer, salah satunya adalah Rumus Wallace. Rumus Wallace merupakan rumus yang sering dipakai karena perhitungannya cukup mudah. Adapun perhitungan rumus Wallace adalah sebagai berikut :

Tmw (P) = (nG + nC) *4 + (nA+nT) *2
Keterangan :
                  Tmw (P)      = Suhu Tm berdasarkan rumus Wallace
                    nG            = Jumlah basa nitrogen G pada primer
                    nC            = Jumlah basa nitrogen C pada primer           
                    nA            =  Jumlah basa nitrogen A pada primer



c. Primer Annealing Temperatur (Ta)

Primer Annealing Temperature (Ta) merupakan suhu ideal  agar primer dapat berkaitan dengan DNA template dengan stabil. Suhu annealing yang terlalu tinggi akan menyulitkan terjadinya ikatan primer PCR sehingga menghasilkan produk PCR yang kurang efisien. Sebaliknya, suhu anneling yang terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan primer pada DNA di tempat yang tidak spesifik. Perhitungan Ta adalah sebagai berikut :

            Ta = 0.3 * Tm (primer) + 0.7 * Tm (produk)
            Keterangan :
            Ta                    :  Primer Annealing Temperatur
            Tm (primer)     : Tm primer PCR
            Tm (produk)    : Tm hasil PCR


d. Jumlah basa GC dalam primer PCR

Jumlah basa GC merupakan banyak basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat dalam suatu primer PCR. Jumlah basa ideal dalam suatu primer adalah 40%-60%. Primer PCR dengan jumlah GC yang rendah dapat menurunkan efisiensi proses PCR yang disebabkan karena primer PCR tidak mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada DNA template.

e. GC Clamp dalam primer PCR

GC clamp adalah jumlah basa Guanin (G) dan Sitosin (C) yang terdapat pada 5 basa terakhir (3’). GC clamp yang bagus adalah sekitar 3 basa G atau C. Keberadaan basa G dan C pada ujung 3’ sangat membantu terjadinya stabilitas ikatan antara primer PCR dengan DNA template.




f. Secondary Structures dalam primer PCR

Secondary structures adalah terjadinya interaksi antar primer PCR yang menyebabkan primer PCR tidak bisa berikatan dengan DNA template sehingga secondary Structures harus dihindari. Secondary structures disebabkan karena antara primer atau basa dalam sebuah primer saling komplementer  dan membentuk suatu ikatan. Ada beberapa macam  secondary structures dari primer, yaitu :

1.  Hairpin dalam primer PCR

Hairpin adalah terjadinya ikatan antar basa nitogen dalam suatu primer  PCR sehingga primer tersebut membentuk suatu loop.

2. Self Dimer dalam primer PCR

Self Dimer adalah terjadinya ikatan antar primer PCR yang sejenis. Forward primer berikatan dengan forward primer lain atau reverse primer berikatan dengan reverse primer lain.

3. Cross Dimer dalam primer PCR

Cross Dimer adalah  terjadinya ikatan antara forward primer dan   reverse primer dalam primer PCR.

Secondary structures dalam primer PCR yang perlu dihindari; a). Hairpain primer PCR, b). self dimer primer PCR, c). Cross Dimer dalam primer PCR

Demikian Postingan tentang Design Primer untuk PCR (Polimerase Chain Reaction). Semoga Bermanfaat.

Kata Kunci :
PCR, Polimerase Chain Reaction, hal yang harus diperhatikan dalam design primer, PCR adalah, berapa Panjang Primer PCR, Primer Melting Temperature (Tm) adalah, annealing primer, Jumlah basa GC dalam primer PCR, GC Clamp dalam primer PCR, Jumlah basa Guanin dan sitosin PCR, Struktur sekunder PCR



Load disqus comments

0 comments